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　　医疗专业问答面试：现在比较常用冷冻干燥保种法保种病毒的病种，具体操作步骤是什么？

　　【参考答案】

　　冷冻干燥保藏法为菌种保藏方法中最有效的方法之一，对一般生活力强的微生物及其孢子以及无芽胞菌都适用，操作步骤如下：

　　1.准备安瓿管，用于冷冻干燥菌种保藏的安瓿管宜采用中性玻璃制造，形状可用长颈球形底的，亦称泪滴型安瓿管，也可用没有球部的管状安瓿管。塞好棉塞，1.05kg/cm，121.3℃灭菌30分钟，备用。

　　2.准备菌种，用冷冻干燥法保藏的菌种，其保藏期可达数年至十数年，为了在许多年后不出差错，故所用菌种要特别注意其纯度，即不能有杂菌污染，然后在最适培养基中用最适温度培养，使培养出良好的培养物。细菌和酵母的菌龄要求超过对数生长期，若用对数生长期的菌种进行保藏，其存活率反而降低。一般，细菌要求24—48小时的培养物;酵母需培养3天;形成孢子的微生物则宜保存孢子;放线菌与丝状真菌则培养7-10天。

　　3.制备菌悬液与分装，以细菌斜面为例，用脱脂牛乳2ml左右加入斜面试管中，制成浓菌液，每支安瓿管分装0.2ml。

　　4.将分装好的安瓿管放低温冰箱中冷冻，无低温冰箱可用冷冻剂如干冰(固体CO2)酒精液或干冰丙酮液，温度可达-70℃。将安瓿管插入冷冻剂，只需冷冻4-5分钟，即可使悬液结冰。

　　5.真空干燥，为在真空干燥时使样品保持冻结状态，需准备冷冻槽，槽内放碎冰块与食盐，混合均匀，可冷至-15℃。装置仪器，安瓿管放入冷冻槽中的干燥瓶内。抽气一般若在30分钟内能达到93.3Pa(0.7mmHg)真空度时，则干燥物不致熔化，以后再继续抽气，几小时内，肉眼可观察到被干燥物已趋干燥，一般抽到真空度26.7Pa(0.2mmHg)，保持压力6-8小时即可。

　　6.封口，抽真空干燥后，取出安瓿管，接在封口用的玻璃管上，可用L形五通管继续抽气，约10分钟即可达到26.7Pa(0.2mmHg)。于真空状态下，以煤气喷灯的细火焰在安瓿管颈中央进行封口。封口以后，保存于冰箱或室温暗处。

　　综上所述，冷冻干燥保藏法步骤多且复杂，每一步都至关重要，在操作过程中要谨慎、认真。

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